Лечение бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Что такое вспомогательные репродуктивные технологии? Эко и пэ расшифровка

Эмбриология

Эмбриология – наука о жизни до рождения.

Первые сведения о развитии зародыша человека в Древней Индии, Древней Греции

в VIII – VI в. до н.э.

Гиппократ «О семимесячном плоде», «О сверхоплодотворении»,

«О природе ребенка»

Леонардо да Винчи – один из основателей эмбриологии, как точной науки.

«Вены ребенка развиваются не в веществе матки его матери, но в плаценте, которая служит как бы сорочкой, одевающей матку изнутри и связана с ней с помощью ворсинок»

Петр I издал указы, предписывающие нежизнеспособных уродов птиц, зверей и человека сдавать в аптеки или коменданту города.

В 1718 г. возникла коллекция Кунсткамеры.

Карл Рейхерт в 1873 году впервые описал зародыш человека в очень раннем возрасте 12 – 13 дней и сделал зарисовки.

Прогенез.

Яйцеклетка, строение, классификация. Яйцеклетка женщины, трубный период развития.

· Ядро, ядрышко. Гаплоидный набор хромосом.

· Цитоплазма, органеллы, много РНК, отсутствует клеточный центр.

· Включения желтка – фосфо- и липопротеины.

· Кортикальные гранулы – производное комплекса Гольджи.

· Мультивезикулярные тельца – производные лизосом.

Типы яйцеклеток

· Алецитальные – не содержит желтка, окружены желточными клетками (беспозвоночные, например, плоские черви).

· Изолецитальные (гр.iso – ровно, однородно), олиголецитальные – желтка мало, равномерно в цитоплазме.

§ а) первично изолецитальные (хордовые, например ланцетник).

§ б) вторично изолецитальные (млекопитающие).

· Телолецитальные (telos – конец), полилецитальные – желтка много, у одного конца (вегетативного полюса), у другого анимального полюса – ядро и органеллы.

§ Умеренно телолецитальные (амфибии).

§ Резко телолецитальные (костистые рыбы, пресмыкающиеся, птицы).

· Центролецитальные – желток в центре клетки вокруг ядра (насекомые).

Яйцеклетка женщины – вторично изолецитальная.

Диаметр 120-130 мкм.

Две дополнительные оболочки:

§ zona pellucida – блестящая оболочка (гликопротеид Zp3 – рецептор для сперматозоидов);

§ corona radiatа – лучистый венец.

Трубный период развития. (около 5 суток)

После овуляции овоцит II порядка захватывают фибрии маточной трубы. В трубе происходит:

Второе деление мейоза и образование из овоцита II порядка яйцеклетки;

Оплодотворение;

Дробление.

Важнейшую роль играет слизистый секрет маточных труб.

Яйцеклетка способна к оплодотворению в течение 1-х суток, жизнеспособна – 2 суток.

Строение сперматозоида, концентрация, подвижность, изменения в женских половых путях.

Описал А. Левенгук в 1677 г.

Длина у человека около 70 мкм.

Две части:

· Головка;

Головка.

· Ядро с гаплоидным набором хромосом, очень плотно упакованных.

· Ядерные белки не гистоны, а богатые аргинином и цистеином – за счет них плотная упаковка.

· В конденсированном состоянии генетический материал защищен от повреждений.

· Акросома – спереди от ядра уплощенный пузырек, производное комплекса Гольджи. Содержит ферменты, необходимые для проникновения сперматозоида в яйцеклетку.

В хвосте 4 части.

· I - шейка

· II – промежуточная

· III - основная

· IV – концевая часть.

Шейка содержит 2 центриоли.

· От проксимальной центриоли отходит аксонема, которая имеет строение реснички

· Дистальная центриоль кольцевидной формы

Промежуточная часть.

· Митохондрии, расположенные по спирали

· Вокруг аксонемы

Основная часть.

· Аксонема.

· Вокруг волокнистая оболочка (тонкофибрильное влагалище).

Концевая часть.

· Аксонема.

· Покрыта непосредственно плазмолеммой.

ü Концентрация сперматозоидов в норме 20-200млн в мл спермы

ü Меньше – олигоспермия, мужское бесплодие.

ü 15% супружеских пар страдают бесплодием

ü 50% - мужское бесплодие!

Подвижность сперматозоидов в среднем 83%.

Приобретают подвижность в семявыносящих путях

Сеть семенника – 0,3 – 0,6%

Головка придатка – 7%

Хвост – 40%

ü Важнейшее значение играет секрет простаты – «второе сердце мужчины»

· Скорость движения сперматозоида – 2-3 мм/мин

· Путь до яичника 30 см преодолевает за 1,5 – 2 часа.

· Подвижность сохраняет до 5 сут., к оплодотворению способны 2 сут.

В кислой среде влагалища сперматозоид погибает через 2,5 часа.

В маточных трубах оптимальная среда:

· Капацитация (активизация) – увеличение подвижности, потребление кислорода, изменения в цитолемме.

· Фагоцитоз неполноценных сперматозоидов, в норме до 10-50 %.

Эмбриогенез человека занимает 10 лунных (28 дней) или 9 календарных месяцев.

Периоды эмбриогенеза.

· Начальный – 1-ая неделя; оплодотворение, дробление.

· Зародышевый – 2-8 неделя; гаструляция и закладка осевых зачатков органов – 2-3 неделя;

гисто – органогенез – 4-8 неделя.

· Плодный – с 3-го месяца до рождения.

Оплодотворение.

Слияние мужской и женской половых клеток с образованием одноклеточного организма – зиготы.

3 фазы:

· Сближение и дистантное взаимодействие.

o Пассивное движение яйцеклетки с током жидкости по яйцеводу.

o Активное движение сперматозоидов.

§ Отрицательный реотаксис – против тока жидкости.

§ Хемотаксис – по градиенту концентрации гиногамонов, выделяемых яйцеклеткой.

§ Электротаксис – электрическое взаимодействие между гаметами.

· Контактное взаимодействие гамет.

o Связывание гамет – множество сперматозоидов связывается с зернистой оболочкой яйцеклетки.

o Акросомная реакция – активизация ферментов акросомы, удаление фолликулярных клеток (денуация).

o Прикрепление к плазмолемме – один сперматозоид преодолевает оболочки, прикрепляется к плазмолемме. Выпячивание цитоплазмы – бугорок оплодотворения.

· Проникновение сперматозоида в яйцеклетку

o Головка и шейка (ядро и центриоли) одного сперматозоида проникают в яйцеклетку (моноспермия).

o Кортикальная реакция – кортикальные гранулы опорожняются в пространство между плазмолеммой и блестящей оболочкой.

o Блестящая оболочка уплотняется, образует оболочку оплодотворения, не пропускающая другие сперматозоиды.

o Сближение ядер – стадия двух пронуклеосов (12 часов).

o Слияние ядер – образование синкариона.

o Сразу начинается первое деление («материнская звезда» в метафазе).

Дробление.

· Ряд митотических делений без последующего увеличений дочерних клеток (бластомеров) до массы материнских. В интерфазе отсутствует G1-период.

· В результате дробление образуется бластула.

· Тип дробления зависит от количества и распределения желтка.

Ланцетник (яйцеклетка первичная изолецитальная).

· Дробление полное, равномерное, синхронное.

· Образуется целобластула.

Амфибии (яйцеклетка умеренно телолецитальная).

· Дробление полное, неравномерное, асинхронное.

· Амфибластула.

Птицы (яйцеклетка резко телолецитальная).

· Дробление неполное.

· Дискобластула.

Человек (яйцеклетка вторично изолецитальная).

· Дробление полное, асинхронное.

· Стадии 2,3,4,5,6,8,9,12,16 до 107 бластомеров.

· Неравномерное, неравноценное.

Два типа бластомеров.

· В центре – крупные темные бластомеры образуют эмбриобласт (зародыш).

· Снаружи – мелкие светлые образуют трофобласт (гр. trophe – пища).

ü Вначале зародыш имеет вид тутовой ягоды – морула

ü Затем появляется полость с жидкостью – бластоциста

ü На 5 сутки ХЭТЧИНГ – выклев бластоциста выходит из zona pellucida, попадает в матку.

Близнецы.

ü Первые бластомеры могут давать самостоятельные организмы (8 бластомеров) – однояйцевые близнецы.

ü Оплодотворение нескольких яйцеклеток – разнояйцевые близнецы.

«Погасите свечу, они выходят на свет»!!!

ü В 1755г. крестьянин села Введенского Яков Кириллов 60 лет был представлен ко двору. Первая жена родила 57 детей (4х4 + 7х3 + 10х2), вторая – 15 детей (1х3 + 6х2). Всего 72 ребенка.

ü 1782г. 27 февраля была прислана ведомость в Москву он Никольского монастыря Шуйского уезда. Федор Васильев 75 лет женатый 2 раза имел 87 детей.

Закономерность.

ü На 87 обычных родов – одна двойня.

ü На 87 двоен – одна тройня.

Имплантация (Нидация).

· Внедрение зародыша в эндометрий

· Начинается на 7 сутки, длится 40 часов

· 1 стадия. Адгезия (прилипание) – с помощью трофобласта зародыш прикрепляется к эндометрию.

· 2 стадия. Инвазия (проникновение).

o Трофобласт диффиринцируется на 2 слоя.

§ Цитотрофобласт.

§ Симластотрофобласт.

Симпластотрофобласт выделяет ферменты, разрушающие эндометрий.

Зародыш погружается в толщу эндометрия, дефект регенерирует.

Питание зародыша.

o В начале гистеотрофный тип – за счёт разрушенных тканей эндометрия;

o Затем гематотрофный тип – за счёт материнской крови.

Эмбриологические аспекты экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбриона (ЭКО и ПЭ).

Около 15 % супружеских пар бесплодны.

Мужское и женское бесплодие 50:50 %.

· Метод разработали англичанине: эмбриолог Роберт Эдвардс и гинеколог Патрик Стептоу.

· Первый «пробирочный» ребёнок родился в Англии в 1978 году - (в России в 1986 году).

· В 1907 году русский исследователь Груздев В.С. проводил опыты на кроликах. Забирал из яичников яйцеклетки, смешивая их со сперматозоидами, и вводил в яйцеводы.

Показания для ЭКО.

· Абсолютное женское бесплодие: полная непроходимость или отсутствие маточных труб.

Этапы ЭКО.

· Исключение мужского фактора бесплодия.

· Обследование женщины.

o Гормональный статус (ФСГ, ЛГ, пролактин, тестостерон, эстродиол и др.).

o Инфекции, передаваемые половым путём.

o Ультразвуковое исследование.

o Томография головного мозга (гипофиз).

o Лапороскопия и гистероскопия (наиболее информативные методы).

· Стимуляция суперовуляции.

o Стимуляция фолликулогенеза препаратами ФСГ.

o Введение в средине цикла овуляторной дозы хорионического гонадотропина (ХГ) - аналога лютеотропного гормона (ЛГ).

· Трансвагинальная пункция и аспирация овоцитов (8-10 овоцитов) через 36 часов после введения овоцитов ХГ.

· Перенос овоцитов в культуральную среду. Оценка качества овоцитов под микроскопом (критерии степени зрелости: наличие одного полярного тельца, состояние cumulus, corona radiata и др.) .

· Отбор зрелых овоцитов.

· Обработка спермы, градиентное центрифугирование с целью отбора фракции наиболее фертильных (активных) сперматозоидов.

· Оплодотворение.

o Добавление в культаральную среду спермы, не менее 50 тыс. подвижных сперматозоидов на 1 овоцит.

o Оптимально через 4 часа после появления одного полярного тельца.

· Культивирование в среде 2 суток (общепринято)

o Дробление: от 2-4 до 6-8 бластомеров.

· Оценка качества зародышей под микроскопом

· Трансвагинальный перенос 2-3 зародышей в матку.

o Остальных зародышей консервируют в жидком азоте.

Вероятность наступления беременности не более чем в 30% на одну попытку

Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида. (ИКСИ-метод)

· Показание: мужское бесплодие (олигоспермия, азооспермия – полное отсутствие эякулята и др.).

· Впервые беременность после ИКСИ получена в 1992 году в Бельгии.

· До этого использовалась донорская сперма.

· При отсутствие эякулята производят пункцию:

o Придатка

· Биоптат помещают в культуральную среду.

· Выбирают 1 нормальный, подвижный сперматозоид.

Оборудование.

· Инвертированный микроскоп на антивибрационном столе

· Два микроманипулятора

· Стеклянные микроинструменты:

o Присоска для яйцеклетки

o Микроигла для сперматозоида.

Этапы.

· Иммобилизация сперматозоида – перетирание хвоста микроиглой о дно чашки.

· Засасывание сперматозоида, первым в пипетку заходит хвост.

· Ориентация и закрепление ооцита на присоске - полярное тельце на 12 или 6 часов (под ним метафизарная пластинка).

· Прокол ооцита на 3 часа – наименьшее повреждение генетического материала (метафизарной пластины)

Донация ооцитов.

Показания: Отсутствие яичников или нефункционирующие яичники.

· Оплодотворяется донорская яйцеклетка по программе ЭКО, зародыш переносится в матку

· Дети генетически чужеродные для родивших их матерей.

· Перед пересадкой зародыша проводятся заместительная гормонотерапия, т.к. у женщины без яичников происходит уменьшение размеров матки и атрофия эндометрия.

· В течение 2-4 месяцев назначаются препараты эстрогенов и прогестерона согласно фазам менструального цикла.

Гаструляция (лат. gaster – желудок).

Процессы размножения, перемещения и дифференцировки клеток, в результате которых образуются зародышевые листки (эктодерма, мезодерма, энтодерма). Зародыш становится многослойным.

Способы гаструляции:

· Инвагинация (ланцетник).

· Эпиболия (амфибии).

· Иммиграция (птицы, млекопитающие).

· Деламинация (высшие позвоночные).

Похожая информация.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии. Сущность способа прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ: в фолликулярной жидкости определяют содержание ФНО- и -ФРФ. Рассчитывают прогностический индекс (ПИ) по формуле: ПИ=0,0027·X+Y·(+8,9626·10 -7 ·Y-3,0827·10 -6 ·X)-0,1448, где Х - количество ФНО-, Y - количество -ФРФ. Получение результата меньше, чем 0,3038 свидетельствует о благоприятном прогнозе для оплодотворения in-vitro. При значении равном или большем, чем 0,3038 прогнозируют неблагоприятный исход оплодотворения in-vitro. Способ позволяет повысить точность и информативность прогноза программы ЭКО и ПЭ.

(56) (продолжение):

CLASS="b560m"FASOULIOTIS SJ et al. Maternal serum levels of interferon-gamma and interleukin-2 soluble receptor-alpha predict the outcome of early IVF pregnancies. Hum Reprod. 2004, 19(6), p. 1357-63, реф.

DRIANCOURT MA et al. Control of oocyte growth and maturation by follicular cells and molecules present in follicular fluid. A review. Reprod Nutr Dev. 1998, 38(4), p. 345-62, реф.

MCNATTY KP et al. Control of early ovarian follicular development. J Reprod Fertil Suppl. 1999, 54, p. 3-16, реф.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и найдет применение для прогнозирования оплодотворения in-vitro с целью повышения эффективности метода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКОиПЭ).

Проблема лечения бесплодия в настоящее время приобретает не только медицинское, социально-демографическое, но и экономическое значение (Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2004). Частота бесплодия в России составляет 10-15%, а в некоторых регионах превышает 15%-ный уровень, определенный проблемной группой ВОЗ как критический, влияющий на демографические показатели (Кулаков В.И., 1999). Сегодня все большее распространение в нашей стране и во всем мире получает метод лечения бесплодия путем экстракорпорального оплодотворения и переноса дробящихся эмбрионов в полость матки пациентки. Если в 1987-1990 эффективность метода составляла 10-15% на один перенос эмбриона, то в настоящее время этот показатель увеличился до 25-35% случаев. Вместе с тем, в клиниках, применяющих метод ЭКО и ПЭ, продолжается поиск новых подходов повышения эффективности метода.

Программа ЭКО и ПЭ сложна в связи с тем, что она многоэтапная, но не все этапы можно объективно проконтролировать. В известной мере часть неудачных исходов ЭКО заложена в самой природе репродуктивного процесса человека, составляющего около 20% для супружеской пары в возрасте 20 лет (Никитин А.И.,1995). В связи с этим возникла идея стимуляции суперовуляции с целью получения большего числа яйцеклеток за счет применения гонадотропинов. Однако увеличение количества яйцеклеток влечет за собой другой отрицательный фактор - некоторые из них могут оказаться неполноценными, с нарушением оогенеза или хромосомной патологией, а другие могут стать на путь обратного развития в процессе фолликулогенеза. С целью улучшения качества ооцитов и предотвращения преждевременного их созревания за счет выброса эндогенного лютеинизирующего гормона в схему стимуляции суперовуляции включают агонисты гонадотропин-рилизинг гормона (Fleming R. et al., 1990).

Весьма важным фактором для исхода ЭКО является состояние мужских половых клеток. В то же время значительный прогресс, связанный с внедрением в практику метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, позволяет иметь потомство мужчинам с тяжелыми формами заболеваний, ранее обреченным на абсолютное бесплодие (Леонов с соавт., 1999).

Готовность эндометрия - важнейшее условие успешной имплантации перенесенного в матку эмбриона (Tabibzadeh S. et al., 1995). При подозрении на наличие нарушений циклической трансформации эндометрия ряд авторов рекомендуют проводить предварительную терапию лекарственными средствами, содержащими прогестерон и эстрадиол (Ffrindler S. et al., 1992).

Очень важным фактором, влияющим на успешность имплантации эмбриона, является процесс его переноса в матку (Tomar et al., 2002). Но в настоящее время существуют различные типы катетеров, обеспечивающие проведение данной процедуры атравматично (Mansour R.T. et al., 2002). Кроме этого, проведение гистерскопии до проведения программы ЭКО позволяет оценить состояние стенок цервикального канала, эндометрия и в случаях наличия патологии произвести соответствующие оперативные вмешательства.

Существенным моментом, оказывающим влияние на успех имплантации эмбриона, является возраст женщины. Однако учитывая использование донорских ооцитов, частота успешных результатов программы ЭКО и ПЭ не различается у пациенток раннего и позднего репродуктивного возраста (Craft J., 1990).

Особое внимание следует уделить инфекционной заболеваемости, поражающей половую систему, что может приводить к нарушению оплодотворения in-vitro и наступлению беременности, препятствовать рождению здорового потомства (Steyaert С.R., et al., 2000). Поэтому существенным моментом в реализации программы ЭКО и ПЭ является своевременное выявление и лечение у супружеской пары инфекций, тесно связанных с репродуктивной системой, входящих в так называемый TORCH-комплекс (токсаплазмоз, краснуха, цитомегаловирусная и герпетическая инфекции, хламидиоз, сифилис, гепатиты А и В, гонококковая инфекция, листериоз) (Кузьмичев Л.Н., 1998).

Определяющим фактором положительного результата программы ЭКО и ПЭ является состояние эмбриона, которое определяет успешность имплантации П (Lenz J.V. et al., 1996). В то же время для того чтобы получить эмбрионы хорошего качества, необходимо, чтобы развитие преовуляторного ооцита не было нарушено в условиях оплодотворения in-vitro.

Исследования последних лет подтверждают гипотезу о том, что множество иммуноактивных цитокинов участвуют в процессах имплантации и плацентарного развития. Изменение материнского Т-хелперного (Th) клеточного ответа, необходимого для наступления нормальной беременности резко изменяется от реакции Thi- к Тh2-типа. Напротив, персистенция ответа Тh1-типа характерна для нарушения течения беременности ранних сроков (Hill J.A. et al., 1995). Это мнение поддерживается многими клиническими исследованиями (Marzi M. et al., 1996; Raghupathy R. et al., 2000; Makhseed M. et al., 2001), в которых убедительно показано, что повышение продукции периферическими лимфоцитами Th1 цитокинов наблюдается у женщин с неблагоприятными результатами программы ЭКО и ПЭ, в отличие от доминирования Th2 реакции, характерной для нормально протекающей беременности.

В то же время получены данные, свидетельствующие о том, что цитокины, в особенности факторы роста, содержащиеся в фолликулярной жидкости, являются важными модуляторами внутриовариальных процессов, регулирующими развития ооцита (Kane M.T. Morgan P.M. Coonan С. Peptide growth factors and preimplantation development// Hum. Reprod. Upd.- 1997-Vol.3 - 137-157).

Сниженное содержание инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в фолликулярной жидкости было выявлено в группе бесплодных пациенток, имеющих эндометриоз, дисфункцию яичников и низкие результаты программы ЭКО и ПЭ (Cunha-Filho J.S.L., Lemos N.A., Freitas F.M., Kiefer K, Faller M.,Passos E.P. // Insulin-like growth factor (IGF)-l and IGF binding protein-1 and -3 in the follicular fluid of infertile patients with endometriosis Hum. Reprod.- 2003-18-423-428).

Некоторые исследователи связывают сниженные концентрации сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР) в фолликулярной жидкости с получением ооцитов и эмбрионов более высокого качества, увеличением частоты наступления беременности (Friedman C.I., Seifer D.B., Kennard E.A., et al.. Elevated level of follicular fluid vascular endothelial growth factor is a marker of diminished pregnancy potential // Fertil. Steril. - 1998-70-836-839; Barroso G., Barrionuevo M., Rao P. et al Vascular endothelial growth factor, nitric oxide, and leptin follicular fluid levels correlate negatively with embryo quality in IVF patients// Fertil. Steril.-1999-V.72-P.1024-1026).

Известно, что более высокие концентрации трансформирующего фактора роста (ТФР- b1) в фолликулярной жидкости достоверно связаны с успешным преэмбриональным развитием, повышенными уровнями имплантации эмбрионов и наступления беременности (van Rooij I.A.J., M.Broekmans F.J., te Velde E.R. Serum anti-Mullerian hormone levels: a novel measure of ovarian reserve// Hum. Reprod.- 2002-17-3065-3071).

Hammadeh M. E. и соавт. (2002) не обнаружили значимых изменений в концентрации колониестимулирующего фактора роста в фолликулярной жидкости при сравнительном изучении пациенток с различными факторами бесплодия (трубным, эндометриозом, бесплодием неясного генеза и мужским фактором) (Hammaden M.E., Ertan A.K., Zeppezauer M. et al.Immunoglobulins and Cytokines Level in Follicular Fluid in Relation to Etiology of Infertility and their.//AJRI 2002-47-82-90).

Однако общими недостатками перечисленных выше работ является: проведение определений факторов роста в фолликулярной жидкости в группах пациенток с различными этиологическими факторами женского и мужского бесплодия, иными словами, отсутствуют критерии включения и исключения в группы исследования по этиологическому принципу. В работах также отсутствует информация о показаниях к проведению программы ЭКО и ПЭ. Также существенным недостатком перечисленных выше работ следует признать отсутствие сведений о содержании факторов роста в фолликулярной жидкости в случаях остановки оплодотворения ооцитов или эмбрионов.

Таким образом, на сегодняшний день накоплены определенные сведения, свидетельствующие о возможном прогнозировании результатов программы ЭКО и ПЭ на основании определения содержания факторов роста в фолликулярной жидкости.

В то же время известно о том, что в группе пациенток с трубным бесплодием при проведении программы ЭКО отсутствие оплодотворения яйцеклеток in-vitro отмечается в 9% случаев, а остановка развития эмбриона в 8,4% случаев (Witkin, S.S et al., 1996). При этом следует особо подчеркнуть, что в России для абсолютного большинства пациенток основным показанием для программы ЭКО и ПЭ является трубное бесплодие.

В связи с чем необходима дальнейшая разработка способов, позволяющих проводить прогнозирование оплодотворения in-vitro, причем в первую очередь для данной категории пациенток, что является особенно актуальным в случаях применения дорогостоящих методов лечения бесплодии, к которым относится ЭКО и ПЭ.

Прототипом изобретения выбран способ оценки развития ооцитов путем исследования маркеров в фолликулярной жидкости, полученной во время пункции фолликулов и аспирации их содержимого при проведении программы ЭКО и ПЭ, с целью определения исходов программы. Сущность данного исследования заключается в том, что в фолликуллярной жидкости определяют более высокие уровни инсулиноподобного фактора роста (ИФР) и низкие интерлейкина-1, что свидетельствуют о благоприятном прогнозе для наступления беременности. (Mendoza С., Ruiz-Requena E., Ortega E., Cremades N., Martinez F., Bemabeu R., Greco, E., Tesarik, J.Follicular fluid markers ofoocyte developmental potential.// Hum. Reprod.-2002-17- 1017-1022).

Недостатками прототипа являются: во-первых, отсутствие четких критериев, при каких значениях исследуемых маркеров следует думать о неблагоприятном исходе программы ЭКО, что снижает точность и информативность данного способа; во-вторых, данное исследование проведено в группе пациенток без патологии со стороны репродуктивной системы, показанием для проведения программы ЭКО был мужской фактор бесплодия, в связи с чем оплодотворение in-vitro осуществлялось с помощью интрацитоплазматической инъекцией сперматозоида, в то время как основными показаниями к проведению программы экстракорпорального оплодотворения является трубное бесплодие; в-третьих, отсутствуют сведения о пациентках, которым перенос эмбрионов не производился в связи с нарушенным оплодотворением in-vitro.

Указанные недостатки устраняются в предлагаемом изобретении. Задача изобретения - повышение точности способа и его информативности.

Поставленная задача решается тем, что после проведения пункции фолликулов, аспирации их содержимого и выделения ооцитов проводится определение средних концентраций ФНО- и -ФРФ. Прогностический индекс (ПИ) получается при расчете формулы: ПИ=0,0027·Х+Y·(+8,9626·10 -7 ·Y-3,0827·10 -6 ·Х)0,1448, где Х- ФНО-, Y- -ФРФ. Значение ПИ равное или больше, чем 0,3038 свидетельствует о том, что оплодотворения in-vitro будет нарушено. Достоверность полученной формулы - P-value: 2,299e-8

Технический результат, получаемый в результате проведения прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ данным способом, заключается в том, что:

1) существенно повышается точность и информативность прогноза исходов программы ЭКО и ПЭ на ранних этапах ее выполнения;

2) можно провести исследование полученного материала во время пункции (фолликулярную жидкость и клеток, содержащихся в ней) с целью своевременного обследования пациентки;

3) повышается результативность следующих программ ЭКО с помощью проведения этиотропной терапии пациентки с учетом результатов обследования;

4) можно принять своевременное решение об интрацитоплазматической инъекции сперматозоида с целью улучшение результата оплодотворения in-vitro;

5) снижается психологическая нагрузка на пациентку, ожидающую информацию о результатах оплодотворения in-vitro и дне переноса эмбрионов вследствие раннего предупреждения о возможном неблагоприятном исходе оплодотворения.

6) снижается лекарственная нагрузка на пациентку за счет исключения ее из программы ЭКО и ПЭ.

Критерием успеха одного из наиболее важных этапов программы ЭКО является получение эмбрионов хорошего качества. В то же время развитие эмбриона in-vitro напрямую связано с состоянием ооцита и интровариальными процессами, обеспечивающими его развитие, которые происходят, как было отмечено выше, при непосредственном участии факторов роста, определение содержания в фолликулярной жидкости которых может способствовать прогнозированию исходов программы ЭКО и ПЭ на ранних этапах ее проведения.

С целью разработки способа прогнозирования результатов программы ЭКО и ПЭ нами было проведено исследование содержания в фолликулярной жидкости факторов роста - ФНО- и -ФРФ в 637 фолликулах у 75 пациенток с трубным фактором бесплодия, обратившихся в Ростовский НИИ акушерства и педиатрии. Из 36 пациенток (1 группа) оплодотворение in-vitro было нарушено на этапе развития яйцеклеток в 61,2% (22) случаев, а на этапе развития эмбрионов в 38,8% (14). Перенос эмбрионов в данной группе не проводился. Во вторую группу исследования были включены 39 пациенток, у которых оплодотворения in-vitro протекало нормально и закончилось переносом эмбрионов. Прогностическая формула (ПИ) была получена на основании сравнительного анализа средних концентраций ФНО- и -ФРФ в группах пациенток с произошедшим оплодотворением in-vitro и с отсутствием оплодотворения in-vitro. Математический анализ проводился с помощью программного обеспечения PolyAnalist 3.5 (Megaputer Intelligence).

Анализ научно-медицинской и патентной литературы позволил установить, что изучению нарушений оплодотворения in-vitro посвящены лишь единичные исследования, сводящиеся к определению неблагоприятного влияния жидкости, содержащейся внутри гидросальпинкса, на развитие и имплантацию эмбриона в эксперименте (Arrighi C.V. et aL, 2001, Carrasco I.et al., 2001, Ajonuma L.C. et al., 2003). В других работах нарушение оплодотворения при культивировании ооцитов связывают с клеточными или генетическими нарушениями, которые называют «фактор ооцита», причем, как подчеркивают сами авторы, данные выводы требуют дальнейшего уточнения (Levran D. et al., 2002).

В то же время большинство пациенток, страдающих трубным бесплодием, имеют хронический воспалительный процесс, который вызывает у них спаечную болезнь органов малого таза. Спайки органов малого таза могут быть последствием реконструктивно-пластической хирургии или тубэктомии. Назначение гонадотропинов во время контролируемой стимуляции суперовуляции может быть одним из факторов, способствующих обострению хронического воспалительного процесса придатков матки, что ведет к появлению клеточных и плазменных медиаторов воспалительного процесса - цитокинов, к которым относятся факторы роста ФНО- и -ФРФ.

ФНО- и -ФРФ, содержащиеся в фолликулярной жидкости, могут быть секретированы клетками гранулезы и лейкоцитами: В-лимфоцитами, моноцитами, естественными киллерами, количество которых увеличено при воспалительных заболеваниях органов малого таза. Теоретически, они также могут попадать в фолликулы из перитонеальной жидкости за счет диффузии через овариальную капсулу в случаях воспалительного процесса органов малого таза, однако эти данные в настоящее время в литературе отсутствуют. Вместе с тем исследование Cheong Y.C. с соавт. (2002) свидетельствует о высоких концентрациях ФНО- в перитонеальной жидкости при спаечной болезни органов малого таза, что может также оказывать негативное влияния на процессы оогенеза. Факторы роста могут оказывать действие на клетки фолликула различными путями: аутокринным, паракринным, интракринным и эндокринным (Mandrup-Poulsen Т. et al., 1995; Vinatier D. et al., 1995). ФНО- может вызвать снижение функции яичников на фоне воспалительного процесса в связи ингибированием стимулируемого гонадотропином стероидогенеза в недифференцированных овариальных клетках вследствие снижения секреции аденилилциклазы и ц-АТФ (Terranova P.F., Rice V.M., 1997). Кроме этого, повышенные концентрации ФНО- в фолликулярной жидкости приводят к апоптозу (Matsubara H. et al, 2000).

В настоящее время получены данные, свидетельствующие о ингибировании продукции эстрогенов ФНО- (Pottratz S.T. et al., 1994). Более того, установлено, что ФНО- ингибирует продукцию прогестерона желтым телом и вызывает атрезию фолликула (Buscher U. et al., 1999, Nash M. A.et al., 1999; Yeh J. and Adashi E.Y., 1999; Doraiswamy V. et al, 2000). Увеличение концентрации ФНО- в фолликулярной жидкости может отрицательно влиять на овуляцию и на оплодотворение in-vitro (Cianci A. et al., 1996) и оказывать эмбриотоксический эффект (Sung L. et al., 1997). С другой стороны, известно, что яичник является органом с чрезвычайно высоким уровнем ангиогенеза (Redmer, D.A. and Reynolds, L.P., 1996) и рост сосудистой части тека-ткани фолликулов регулируется -ФРФ (Schams D. et al., 1996). Существует также гипотеза, что низкие уровни эстрогенов в сыворотке крови, недостаточные для пролиферации клеток, зависят от различных факторов роста, в том числе от -ФРФ (Hermenegildo С., Сапо А., 2000). Имеются также сведения о важном значении -ФРФ для предимлантационного развития эмбриона (Chai N. et al., 1998).

Проведенные исследования позволили установить зависимость между концентрациями ФНО- и -ФРФ в фолликулярной жидкости и оплодотворением in-vitro. Определение содержания указанных факторов роста позволяет прогнозировать результат оплодотворения in-vitro на ранних этапах проведения программы ЭКО и ПЭ.

Подробное описание способа и примеры его конкретного применения.

Для реализации способа используют следующую аппаратуру: стандартный набор оборудования и оснащения для лабораторий ЭКО и ПЭ, фотометр (Victor, 1420 Multilabel counter, Wallac, Финляндия). Уровень концентраций в фолликулярной жидкости цитокинов определяли с помощью коммерческих тест-систем ФНО- (CytElisa) и -ФРФ (ACCUCYTE) (CYTIMMUNE, Science INC., США).

Стимуляция суперовуляции проводится по «короткому протоколу» с использованием аналога гонадолиберина (Диферелин, Бофур Ипсен) в ежедневной дозе 0,1 мг, который назначается в первый день менструального цикла после ультразвукового исследования. На следующий день начинают стимуляцию фолликулогенеза введением препаратов рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (Пурегон, Органон) в суточной дозе 150-250 ME. Стимуляция проводят до дня достижения лидирующими фолликулами диаметра 18 мм, определяемого при трансвагинальной эхографии, после чего назначают инъекцию «овуляторной дозы» хорионического гонадотропина (Прегнил, Органон).

Через 35-36 часов после инъекции хорионического гонадотропина проводится трансвагинальная пункция фолликулов и аспирация преовуляторных ооцитов. Трансвагинальная пункция производится в гинекологическом кресле с помощью ультразвукового аппарата «ALOKA SAL500» (Япония). Промежность и влагалище дезинфицируются. Пациентку укрывают простынями, оставляя открытой промежность. С помощью влагалищного датчика с установленной на нем специальной насадкой для пункционной иглы проводится ультразвуковое исследование органов малого таза для выбора оптимальной позиции расположения пункционной траектории. После определения правильного направления пункционной траектории через просвет насадки влагалищного ультразвукового датчика проводится пункция содержимого фолликулов с помощью иглы. Аспирация содержимого фолликулов производится с использованием вакуум-отсоса, под давлением 80 мм рт.ст., обеспечивающим поступление аспирата в стерильные пробирки. Полученную фолликулярную жидкость передают эмбриологу для идентификации и выделения из нее ооцитов. Подготовка спермы проводится с использованием методики swim-up в среде Mtdium B1 (CCD, Франция). Аспирированные ооциты инсеминируются и культивируются в среде В2 INRA MEDIUM (CCD, Франция). Образцы фолликулярной жидкости центрифугируются при скорости 400 g в течение 10 минут и чистая фракция используется для определения в ней ФНО- и -ФРФ. Методика определения ФНО- и -ФРФ описана в инструкции производителя коммерческого набора.

Полученные значения ФНО- и -ФРФ подставляются в формулу расчета ПИ=0,0027·X+Y·(+8,9626·10 -7 ·Y-3,0827·10 -6 ·X)-0,1448, где Х - ФНО-, Y - -ФРФ, и если значение ПИ равное или больше, чем 0,3038, то прогнозируют неблагоприятный исход ЭКО и ПЭ, что является показанием для исключения женщины из программы и направление ее на дополнительное обследование.

Приводим клинические примеры, подтверждающие работоспособность способа.

Пациентка П-ва Л.В., 35 лет, история болезни №582/60, дата пункции фолликулов 14.06.01.

Диагноз: Хронический двухсторонний сальпингит. Состояние после сальпингоовариолизиса, сальпингостомии. Синдром Фитц-Хью-Куртиса. Вторичное бесплодие.

Средние концентрации составили ФНО-=20,5 пг/мл, -ФРФ=167,5 нг/мл.

После подстановки полученных данных в формулу было получено значение ПИ=-0,0501, что свидетельствовало о благоприятном исходе ЭКО. В результате культивирования ооцитов in-vitro были получены эмбрионы и осуществлен их перенос.

Пациентка Ч-ва Н.В. 28 лет, история болезни №4094/441, дата пункции фолликулов 19.06.02г.

Средние концентрации составили ФНО-=315,1 пг/мл, -ФРФ=1210,0 нг/мл.

После подстановки полученных данных в формулу было получено значение ПИ = 1,1933, что свидетельствовало о неблагоприятном исходе ЭКО. В результате культивирования ооцитов оплодотворение in-vitro не произошло, эмбрионы получены не были.

Пациентка Ш-к И.В., 33 года, история болезни №2529/286, дата пункции фолликулов 13.04.02 г.

Диагноз: Состояние после 2-сторонней тубэктомии. Спаечная болезнь органов малого таза. Вторичное бесплодие.

Средние концентрации составили ФНО-=87,0 пг/мл, -ФРФ=482,3 нг/мл.

После подстановки полученных данных в формулу было получено значение ПИ = 0,3038, что свидетельствовало о неблагоприятном исходе ЭКО и ПЭ. В результате культивирования ооцитов оплодотворение in-vitro не произошло, эмбрионы получены не были.

По материалам заявляемого способа прогнозирования программы ЭКО и ПЭ нами обследовано 152 пациентки, обратившихся для проведения экстракорпорального оплодотворения по поводу трубного бесплодия в Ростовский НИИ акушерства и педиатрии. Возраст обследованных больных колебался от 24 до 36 лет, в среднем составляя 29,4±2,2 года. Из них у 59% диагностировано первичное бесплодие, у 41%-вторичное. Длительность бесплодия варьировало от 6 до 14 лет, составляя в среднем 7,4±2,1 года. У 11 пациенток значения ПИ составили более 0,3038, оплодотворение in-vitro в этих случаях не произошло, что послужило основаниям для проведения их дальнейшего обследования. У остальных пациенток значения ПИ составили менее 0,3038, оплодотворение in-vitro в этих случаях произошло и им был произведен перенос эмбрионов.

Заявляемый метод основан на использовании стандартного лабораторного оборудования, не требует технической модификации. Использование данной методики позволяет врачу в первые сутки культивирования ооцитов предсказать результат оплодотворения с целью разработки дальнейшей тактики ведения пациентки и проведения дополнительных лабораторных исследований с целью уточнения причин нарушения оплодотворения. Заявленный способ может использоваться в гинекологических стационарах, использующих программу ЭКО и ПЭ.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ прогнозирования исхода программы ЭКО и ПЭ путем исследования фолликулярной жидкости, отличающийся тем, что в фолликулярной жидкости проводят количественное определение содержания ФНО- и -ФРФ, рассчитывают прогностический индекс (ПИ) по формуле

ПИ=0,0027·Х+Y·(+8,9626·10 -7 ·Y-3,0827·10 -6 ·Х)-0,1448,

где Х - количество ФНО-, Y - количество -ФРФ, и при значении ПИ, меньшем, чем 0,3038, прогнозируют благоприятный исход оплодотворения in-vitro, а при значении, равном или большем, чем 0,3038, прогнозируют неблагоприятный исход оплодотворения in-vitro.

Первое ЭКО было произведено в 1944 J.Rock, M.Melkin культивировали ооцит человека и произвели ЭКО приведшее к развитию двухклеточного эмбриона. В 1978 году родился первый ребенок после ЭКО и ПЭ . ЭКО используют в мировой практике терапии бесплодия с 1978 г. В России данный метод успешно реализован в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, где в 1986 г. благодаря работам профессора Б.В. Леонова родился первый ребенок «из пробирки».

В наше время этот метод получил настолько широкое распространение, что давно уже перестали подсчитывать число детей, родившихся после ЭКО . Бурный прогресс метода обусловлен успехами фармакологии и эхоскопии, биохимии. Синтезированы препараты, позволяющие стимулировать в яичнике суперовуляцию - развитие сразу нескольких фолликулов, содержащих яйцеклетку. Внедрены в практику эхоскопические приборы с высокой разрешающей способностью и оснащенные влагалищными датчиками и инструменты для забора яйцеклетки через свод влагалища под ультразвуковым контролем. Все это облегчило проведение метода и привело его распространению. Во многих странах Европы и Америке ЭКО относят к рутинным методам лечения бесплодия. Бурное обсуждение моральных, этических и юридических аспектов ЭКО отошло в прошлое. Допустимо и практикуется оплодотворение спермой донора, имплантация «чужого» эмбриона, расширены возрастные границ ЭКО . Опубликованы случаи рождения детей после ЭКО у женщин в возрасте старше 50 лет. Вряд ли к последнему следует относиться положительно по вполне понятным соображениям медицинского характера: например, как перенесет женщина в климактерическом возрасте беременность и как это отразится на потомстве? Тем не менее, приведенные примеры свидетельствуют о том, что детали метода четко: отработаны.

Частота бесплодных браков в России превышает 15%, что, по данным ВОЗ, считают критическим уровнем. В стране зарегистрировано более 5 млн бесплодных супружеских пар, из них более половины нуждаются в использовании методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). По экспертной оценке, показатель только женского бесплодия за последние 5 лет увеличился на 14%.

Основой для развития целого ряда подходов, которые в настоящее время объединены общим термином «вспомогательные репродуктивные технологии» (ВРТ), стал классический метод ЭКО и пересадка эмбриона (ПЭ ) в полость матки. При этом ооциты (женские половые клетки) после культивирования в специальной питательной среде оплодотворяют спермой, которую предварительно центрифугируют и обрабатывают в питательной среде.

Виды ВРТ:

●вынашивание эмбриона женщиной-добровольцем («суррогатное» материнство) для последующей передачи ребенка (детей) генетическим родителям;

●донорство ооцитов и эмбрионов;

●ИКСИ (аббревиатура «ИКСИ» произошла от английской аббревиатуры «ICSI», то есть «IntraCytoplasmic Sperm Injection», при переводе на русский язык это значит «введение сперматозоида в цитоплазму» (то есть в яйцеклетку);

●криоконсервация ооцитов и эмбрионов;

●преимплантационная диагностика наследственных заболеваний;

●редукция эмбрионов при многоплодной беременности;

●собственно ЭКО и ПЭ.

По отношению к пациентам программы ЭКО необходимо, чтобы речь шла о бесплодии супружеской пары в целом . Это принципиально меняет подход к отбору пациентов и их подготовке к программе - делает обязательной предварительную оценку состояния репродуктивной системы как женщин, так и мужчин.

Приблизительно 40% случаев бесплодия среди супружеских пар обусловлено мужским бесплодием. Метод ИКСИ позволяет иметь потомство мужчинам с тяжелыми формами бесплодия (олиго, астено, тератозооспермиями тяжелых степеней), иногда лишь при наличии единичных сперматозоидов в пунктате, полученном при биопсии яичка.

ЭКО с использованием ооцитов донора применяют для преодоления бесплодия в тех случаях, когда у женщины невозможно получить собственные ооциты или получают некачественные ооциты, не способные к оплодотворению и развитию полноценной беременности.

Программа «суррогатного» материнства - единственный метод получения генетически своего ребенка для женщин с отсутствующей маткой или с выраженной экстрагенитальной патологией, когда вынашивание беременности невозможно или противопоказано.

Преимплантационную диагностику также основывают на методе ЭКО . Её цель - получение эмбриона на ранних стадиях преимплантационного развития, обследование его на генетическую патологию и ПЭ в полость матки.

Операцию редукции выполняют при наличии более трёх эмбрионов. Это - вынужденная процедура, но необходимая для успешного течения многоплодной беременности. Рациональное и научно обоснованное применение редукции, а также совершенствование техники её выполнения при многоплодной беременности позволяет оптимизировать клиническое течение такой беременности, прогнозировать рождение здорового потомства и снизить частоту перинатальных потерь.

Ц елью вспомагательных репродуктивных технологий является получение здорового потомства у бесплодных супружеских пар.

Показания к ЭКО

●абсолютное трубное бесплодие при отсутствии маточных труб или их непроходимости;

●бесплодие неясного генеза;

●бесплодие, не поддающееся терапии, или бесплодие, вероятность преодоления которого с помощью ЭКО выше, чем при использовании других методов;

●иммунологические формы бесплодия (наличие антиспермальных АТ по МАР–тесту ≥50%);

●различные формы мужского бесплодия (олиго, астено или тератозооспермии), требующие применения метода ИКСИ;

●синдром поликистозных яичников;

●эндометриоз.

Противопоказания

●врождённые пороки развития или приобретённые деформации полости матки, при которых невозможна имплантация эмбрионов или вынашивание беременности;

●доброкачественные опухоли матки, требующие оперативного лечения;

●злокачественные новообразования любой локализации (в том числе в анамнезе);

●опухоли яичников;

●острые воспалительные заболевания любой локализации;

●соматические и психические заболевания, которые противопоказаны для вынашивания беременности и родов.

Подготовка

Объём обследования супружеской пары перед проведением ЭКО регламентирован приказом Министерства здравоохранения РФ от 26 февраля 2003 г. № 67 «О применении ВРТ в терапии женского и мужского бесплодия».

Для женщины обязательны:

●заключение терапевта о состоянии здоровья и возможности вынашивания беременности;

●исследование на микрофлору из уретры и цервикального канала и степень чистоты влагалища;

●клинический анализ крови, включая определение времени свёртывания крови (действителен 1 мес);

●общее и специальное гинекологическое обследование;

●определение группы крови и резус-фактора;

●УЗИ органов малого таза.

По показаниям дополнительно проводят:

●бактериологическое исследование материала из уретры и цервикального канала;

●биопсию эндометрия;

●инфекционное обследование (хламидии, уреаплазма, микоплазма, ВПГ, ЦМВ, токсоплазма, вирус краснухи);

●исследование состояния матки и маточных труб (гистеросальпингография или гистеросальпингоскопия и лапароскопия);

●обследование на наличие антиспермальных и антифосфолипидных АТ;

●определение в плазме крови концентраций ФСГ, ЛГ, эстрадиола, пролактина, тестостерона, кортизола, прогестерона, гормонов щитовидной железы, ТТГ, СТГ;

●цитологическое исследование мазков шейки матки.

При необходимости назначают консультации у других специалистов.

Для мужчины обязательны:

●анализ крови на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С (действителен 3 мес);

●спермограмма.

По показаниям проводят:

●инфекционное обследование (хламидии, уреаплазма, микоплазма, ВПГ, ЦМВ);

●FISH-диагностика сперматозоидов (метод флуоресцентной гибридизации in situ);

●определение группы крови и резус-фактора.

Также назначают консультацию у андролога.

Для супружеской пары старше 35 лет необходимо медико-генетическое консультирование.

Методика

Процедура ЭКО состоит из следующих этапов:

●отбор, обследование и при обнаружении отклонений - предварительная подготовка пациентов;

●стимуляция суперовуляции (контролируемая овариальная стимуляция), с целью получения нескольких зрелых яйцеклеток и как результат — развитие нескольких эмбрионов, что повышает вероятность наступления беременности.

●пункция фолликулов яичников с целью получения преовуляторных ооцитов. Пункция выполняется амбулаторно, под анестезией, через задний свод влагалища.

●инсеминация ооцитов и культивирование развившихся в результате оплодотворения эмбрионов in vitro. Оплодотворение яйцеклеток специально подготовленной спермой мужа (партнера) в условиях лаборатории. Фолликулярную жид­кость, полученную в результате пунк­ции, выливают в специальную чашку и просматривают под микроскопом с тем, чтобы убедиться в наличии яй­цеклетки. Затем яйцеклетки переносят в чашку со специальной средой для культивирования. Чаш­ку помещают в инкубатор, в котором поддерживается постоянная темпера­тура и определенный состав газовой смеси. Яйцеклетки оставляют в инку­баторе на несколько часов для того, чтобы они адаптировались к новым условиям. После чего к ним добавляют сперматозоиды - эта процедура на­зывается инсеминацией. Как свежая (нативная), так и криоконсервиро- ванная сперма перед использованием обрабатывается для того, чтобы выде­лить нормальные и подвижные спер­матозоиды. Контроль оплодотворения обычно проводится через 12-18 часов.

●перенос эмбрионов в полость матки может быть осуществлен через 48-120 часов после получения яйцеклеток. Для переноса эмбриона используются специальные катетеры, которые вводятся в полость матки через шеечный канал. В большинстве случаев пациентке переносят 2 эмбриона.

●поддержка периода после переноса эмбрионов после переноса эмбриона проводится гормональная поддержка, обычно, препаратами прогестерона. В зависимости от индивидуальных показаний могут подключаться препараты эстрогена и хорионического гонадотропина.

●диагностика беременности на ранних сроках по содержанию ХГ в крови или в моче осуществляется через 12-14 дней от момента переноса эмбрионов. Ультразвуковая диагностика беременности может проводиться с 21 дня после переноса эмбрионов. Диагноз «клиническая беременность» устанавливается при обнаружении плодного яйца в полости матки.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ

По данным Европейской ассоциации репродуктологов в Европе на сегодняшний день проводят более 290 000 циклов ВРТ в год, из них 25,5% заканчиваются родами; в США - более 110 000 циклов в год с частотой наступления беременности в среднем 32,5%.

В клиниках России ВРТ проводят 10 000 циклов в год, при этом частота наступления беременности составляет около 26%.

ОСЛОЖНЕНИЯ

●аллергические реакции на препараты для стимуляции овуляции;

●воспалительные процессы;

●кровотечение;

●многоплодная беременность;

●синдром гиперстимуляции яичников, возникающий, как правило, после ПЭ, - состояние, характеризующееся увеличением размеров яичников и формированием в них кист. Это состояние сопровождается повышением сосудистой проницаемости, гиповолемией, гемоконцентрацией, гиперкоагуляцией, асцитом, гидротораксом и гидроперикардом, электролитным дисбалансом, увеличением концентрации эстрадиола и онкомаркера СА-125 в плазме крови;

●эктопическая внематочная беременность. Частота возникновения внематочной беременности при использовании ВРТ колеблется от 3% до 5 %.

Таким образом, ЭКО и ПЭ достаточно сложны и требуют дорогостоящих оборудования, реактивов, препаратов и главное - специальных знаний. Это привело к тому, что ЭКО и ПЭ являются обособленной областью гинекологической практики и выполняются только специалистами.

Разработка метода ЭКО вывела проблему лечения бесплодия из тупика и позволила добиться наступления беременности у огромного числа женщин, ранее обречённых на бездетность.

Абсолютными показаниями являются отсутствие (оперативное удаление) маточных труб или непроходимость обеих труб в результате воспалительных процессов или оперативных вмешательств на органах малого таза.

Относительные показания :

Консервативно-пластические операции на трубах, если в течение года после операции беременность не наступила; некоторые авторы допускают период ожидания 2 года.

Эндометриоз при отсутствии эффекта от консервативного (с применением препаратов аГнРГ) и хирургического лечения в течение 6-12 мес.

Бесплодие неясного генеза.

Иммунологическое бесплодие с высоким титром антиспермальных антител.

Перед проведением ЭКО на 3-й день цикла проводится определение «фолликулярного резерва» - определение ФСГ. Повышение его уровня выше 15 МЕ/л на 3-й день цикла (время селекции доминантного фолликула) указывает на снижение «фолликулярного резерва».

При отборе пациентов проводится тщательное обследование:

для выявления и лечения воспалительных заболеваний влагалища, шейки, эрозии шейки матки. При хроническом воспалительном процессе в трубах или сактосальпинксе рекоменду­ется их удаление, как возможных источников инфекции и внематочной беременности. Кроме того жидкость, содержащаяся в сактосальпинксе, обладает эмбриотоксическим действием.

Важнейшим этапом программы ЭКО является стимуляция суперовуляции. Для проведения ЭКО необходимо развитие нескольких фолликулов, что значительно повышает частоту наступления беременности.

Последовательность проведения программы ЭКО и ПЭ:

1. Подавление уровня эндогенных гонадотропинов и десенситизация гипофиза.

2. Стимуляция суперовуляции препаратами гонадотропных гормонов.

3. Забор ооцитов путем пункции яичников через своды вла­галища под УЗ-контролем.

4. Оплодотворение ооцитов сперматозоидами в специаль­ных средах и содержание их до стадии 6-8 бластомеров.

5. ПЭ на 6-8-й клеточной стадии в полость матки. Перено­сится не менее 3-4 эмбрионов, так называемый феномен поддержки. В тех случаях, когда имплантируются 3 и более эмбрионов, оставляют не более 2, а остальных уда­ляют, отсасывая специальным инструментом (редукция эмбрионов).

6. Гормональная поддержка лютеиновой фазы.

Стимуляция суперовуляции наиболее эффективна после десенситизации гипофиза пролонгированными препаратами аГнРГ (золадекс, диферелин, декапептил, бусерелин-депо). Это позволяет исключить влияние эндогенных гонадотропинов и синхронизировать созревание нескольких фолликулов. Пролонгированный препарат (декапептил, золадекс) вводят на 21-й день цикла, предшествующего стимуляции cyперовуляции. Менструация начинается, как правило, в срок, и с 3-го дня цикла начинают введение одного из препаратов ФСГ (см. выше), которое продолжается до 14-го дня цикла. Дозы и мониторинг не отличаются от таковых в коротком протоколе

Для стимуляции овуляции наиболее успешные результаты наблюдаются при использовании препаратов рекомбинантного ФСГ, не содержащего примесей ЛГ - пурегон и высокоочищенный препарат ФСГ - метродин. Эффективность действия этих препаратов понятна, если вспомнить, что в гормональнозависимом этапе фолликулогенеза и селекции доминантного фолликула основную роль играет ФСГ. В качестве овуляторной дозы гонадотропина вводится препарат, содержащий в oсновном ЛГ - хорионический гонадотропин (профази, прегнил, хорагон). Препараты ФСГ (меногон, пурегон) начинают вводить со 2-го дня цикла и вводят ежедневно в количестве от 2 до 4 ампул, каждая из которых содержит 75 ед. гормона до 14-го дня цикла. Доза определяется гормональным и УЗ-мониторингом. УЗИ проводят на 7, 9, 11, 12, 13-й дни цикла, определяя размер фолликула и толщину М-эха.

Критерием зрелости доминантных (3 и более) фолликулов является не менее 150 пг/мл Е 2 в расчете на каждый фолликул диаметром не менее 15 мм. При достижении этих параметров вводится разрешающая доза ХГ 10 000 ед. (хорагон, профази, прегнил).

Диагноз беременности устанавливают на основании подъема ХГ на 16-й день цикла после ПЭ (так называемая биохимическая беременность).

Частота наступления беременности при использовании программ ЭКО, по данным разных авторов, колеблется от 20 до 60 %. Частота многоплодной беременности при ЭКО значительно выше, чем в популяции, и достигает 12-15%, внематочной беременности - 6%, самопроизвольное прерывание беременности - до 29%.

Контрольные вопросы:

1. Что называется бесплодным браком?
2. Каковы популяционные данные?
3. Какова частота бесплодия в браке?
4. Какие существуют женские факторы бесплодия?
5. Какая существует классификация женского бесплодия в браке?
6. Что такое первичное бесплодие?
7. Что такое вторичное бесплодие?
8. Что такое абсолютное женское бесплодие?
9. Какие известны причины женского бесплодия?
10. Что такое эндокринное бесплодие?
11. Какие выделяют виды эндокринного бесплодия?
12. Как характеризуется ановуляции как один из видов эндокринного бесплодия?
13. Дайте характеристику недостаточности лютеиновой фазы (НЛФ) менструального цикла как одного из видов эндокринного бесплодия.
14. Каковы патогенетические механизмы НЛФ?
15. Каковы основные причины НЛФ?
16. Что такое синдром лютеинизации неовулировавшего фолликула (ЛНФ-синдром)?
17. Каковы причины ЛНФ-синдрома?
18. Какие особенности анамнеза позволяют предположить связь бесплодия с эндокринной патологией?
19. Какова частота трубного бесплодия?
20. Какие физиологические изменения происходят в маточных трубах?
21. Какие выделяют трубно-перитонеальные факторы бесплодия?
22. Какие причины приводят к нарушению функции маточных труб?
23. Какие причины приводят к органическим поражениям маточных труб?
24. Что является причиной развития перитонеального бесплодия?
25. Какие особенности анамнеза позволяют предположить связь бесплодия с патологией маточных труб?
26. Какие существуют методы диагностики трубного бесплодия?
27. Какие существуют методы диагностики перитонеального бесплодия?
28. Каковы причины маточной формы бесплодия?
29. Какие существуют методы диагностики маточной формы бесплодия?
30. Какие существуют методы лечения?
31. Каков прогноз?
32. Чем обусловлены иммунологические факторы бесплодия?
33. Что такое психогенные факторы бесплодия?
34. Каков алгоритм первичного обследования бесплодной пары?
35. Каковы основные задачи анамнеза?
36. Что включает объективное обследование:
37. Какими исследованиями можно заменить длительное измерение ректальной температуры для определения овуляции?
38. Что такое мужское бесплодие?
39. Какова частота мужского бесплодия?
40. Каковы мужские факторы бесплодия?
41. Какие особенности анамнеза позволяют предположить связь бесплодия с мужскими факторами?
42. Какова цель и принципы лечения бесплодия в браке?
43. Что относится к современным методам лечения бесплодия?
44. Каков алгоритм лечения бесплодия?
45. Каковы показания для индукции овуляции гонадотропными препаратами?
46. Какие группы препаратов применяют для стимуляции овуляции?
47. Каковы варианты стимуляции овуляции различными группами лекарственных средств?
48. Каковы хирургические методы лечения женского бесплодия в браке?
49. Что такое вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ)?
50. Что относится к ВРТ?
51. Что такое искусственная инсеминация?
52. Какие показания к ИСМ у женщин?
53. Какие методы введения спермы?
54. Какие показания к ИСД?
55. Какие противопоказания к ИСД и ИСМ?
56. Какое обследование проводится перед ИСМ и ИСД?
57. Какие этапы проводятся при ИСМ?
58. Сколько раз можно проводить ИСД и ИСМ?
59. Как часто наступает беременность?
60. Какие показания к ЭКО?
61. Какое обследование проводят перед ЭКО? Какова последовательность проведения программы ЭКО и ПЭ?
62. Какими препаратами проводится десенситизации гипофиза?
63. Какова методика стимуляции суперовуляции?
64. Как вводятся препараты ФСГ?
65. Что является критерием зрелости доминантных фолликулов?
66. На каком основании устанавливается диагноз беременности?
67. Какова эффективность ЭКО?

Задача № 1

Больная Н., 35 лет, обратилась к гинекологу по поводу отсутствия беременности в течение года. Менструации с 11 лет регулярные, через 28 дней по 5 дней, умеренные, безболезненные. В анамнезе одни нормальные роды и искусственный аборт, которые протекали без осложнений. План обследования и предположительный диагноз?

Задача № 2

Больная М., 26 лет, обратилась к гинекологу для установления диагноза и лечения по поводу самопроизвольных абортов. Менархе с 12 лет, менструальный цикл регулярный, менструации через 28 ней по 5-6 дней. В 21 год больная начала применять ОК. через год она прекратила их использовать, когда решила забеременеть. Через 3 месяца наступила беременность, в 12 недель произошел самопроизвольных аборт. После выскабливания больная снова использовала ОК в течение 6 месяцев. Через 3 месяца после их отмены вновь наступила беременность, но в 26 недель произошел самопроизвольный аборт. План обследования? Предположительный диагноз?

При недостаточном для проведения ИИСМ ко­личестве сперматозоидов или при
отсутствии эф­фекта от ВМИ в течение нескольких циклов может быть проведено ЭКО, когда
сперматозоиды опло­дотворяют ооцит вне организма — in vitro , или «в
пробирке».

Вначале метод ЭКО и ПЭ применялся преиму­щественно при бесплодии,
обусловленном непрохо­димостью маточных труб или их отсутствием. В та­ких случаях метод
предусматривает получение яйце­клеток из яичника женщины, оплодотворение их in vitro и перенос
эмбриона в полость матки после не­скольких его дроблений в пробирке. Метод разрабо­тан Р. Эдвардсом и
П. Стептоу (Англия, 1978) и на­зван ими in vitro fertilization and miotransfer (IVF&ET).

Процедура ЭКО состоит из следующих этапов:

• отбор и обследование пациентов;
• индукция суперовуляции, включая мониторинг фолликулогенеза и развития эндометрия;
• пункция фолликулов яичников;
• инсеминация ооцитов и культивирование эмб­рионов in vitro ;
• перенос эмбрионов в полость матки;
• поддержка лютеиновой фазы стимулирован­ного менструального цикла; S диагностика беременности на
  ранних сроках.

Последние 15 лет внимание специалистов, рабо­тающих в программе ЭКО и ПЭ, привлечено к
схе­мам стимуляции суперовуляции с использованием агонистов гонадотропего-рилизинг-гормона (а-ГнРГ),
которые представляют собой группу синтетических соединений, сходных с естественным ГнРГ.

В соответствии с двухфазностью действия а-ГнРГ в программе ЭКО и ПЭ используют две
принципи­альные схемы стимуляции суперовуляции.

При так называемой «короткой» схеме введение а-ГнРГ и ЧМГ (ФСГ) начинают в ранней
фоллику-линовой фазе одновременно или ЧМГ (ФСГ) на­значают через 2—3 дня после первого введения а-ГнРГ
— в фазу активации аденогипофиза. Блокада функциональной активности аденогипофиза возни­кает уже
после начала стимуляции суперовуляции. Так, декапептил в ежедневной дозе 0,1 мг вводят подкожно со
второго дня менструального цикла до назначения овуляторной дозы ХГ. Стимуляцию су­перовуляции ЧМГ
начинают с пятого дня менстру­ального цикла с 2—3 ампул ЧМГ (75 ME— 225 ME) и проводят с соблюдением
критериев УЗИ и гормо­нального мониторинга до дня введения ХГ.

При использовании длинной схемы, считающей­ся «золотым стандартом», введение
а-ГнРГ начина­ют в ранней фолликулиновой или в середине лютеи­новой фазы цикла, предшествующего
стимуляции суперовуляции. Могут применяться а-ГнРГ как для ежедневного введения, так и депонированные
фор­мы. Большинство клиницистов предпочитают еже­дневные подкожные инъекции а-ГнРГ, так как они
более экономичны, имеют высокую клиническую эффективность и хорошо переносятся.

Сейчас чаще всего для достижения блокады функциональной активности аденогипофиза
ис­пользуют декапептил или диферелин для ежедневно­го подкожного введения в дозе 0,1 мг и
депо-дека-пептил для внутримышечного введения в дозе 3,75 мг, а в качестве стимулятора суперовуляции
— препара­ты ЧМГ и рекомбинантный ФСГ.

Через 10—17 дней от первого введения а-ГнРГ в результате снижения рецепторов ГнРГ в
клетках аденогипофиза (десенситизация) уровень гонадо-тропинов в плазме крови снижается до базального
(соответственно происходит блокада гонад) и пре­кращается спонтанное развитие фолликулов в
яич­никах.

Стимуляцию препаратами ЧМГ (ФСГ) начина­ют только после достижения блокады
секретор­ной активности аденогипофиза и вторично — яич­ников.

Критерии начала стимуляции суперовуляции в «длинных» схемах с использованием
а-ГнРГ и ЧМГ (ФСГ):

• снижение концентрации Е 2 в плазме крови до 30—50% от исходного уровня (менее 100 пмол/л или 30
  пг/мл);
• толщина эндометрия не более 5 мм.

Стимуляцию суперовуляции в схемах с исполь­зованием а-ГнРГ следует
проводить с обязательным использованием УЗИ и гормонального мониторинга независимо от формы введения
препарата и фазы менструального цикла, в которой оно начато.

Ежедневную дозу ЧМГ (ФСГ) в первые пять дней стимуляции определяют с учетом количества
фолликулов, полученных при предшествующих по­пытках ЭКО и ПЭ, и, как правило, она не превы­шает 2-3
ампул ЧМГ (ФСГ) (150 ME- 225 ME) в день до дня введения овуляторной дозы ХГ.

Определение времени введения овуляторной дозы ХГ — также один из ключевых моментов
про­ведения программы ЭКО и ПЭ. Овуляторная доза ХГ назначается после достижения уровня Е 2 в
плаз­ме крови не менее 1000 пмол/л (300 пг/мл) из рас­чета на каждый лидирующий фолликул, при разме­рах
лидирующих фолликулов 18—20 мм и толщине эндометрия не менее 9 мм. При наличии в одном или обоих яичниках
1—5 фолликулов овуляторная доза ХГ составляет обычно 5 тыс. MEХГ, если име­ется более 10 фолликулов
— 10 тыс. MEХГ. В каждом случае овуляторная доза ХГ определяется индивидуально.

При рассмотрении схем стимуляции суперовуля­ции нельзя и не упомянуть об антагонистах
ГнРГ. Использование антагонистов ГнРГ в схемах стиму­ляции суперовуляции в программе ЭКО и ПЭ имеет ряд
преимуществ перед применением а-ГнРГ: бло­када гонадотропной активности аденогипофиза воз­никает в
течение нескольких часов, без предшеству­ющей фазы активации; возможно не только предотвращение, но и
прекращение уже начавшегося «па­разитарного» пика ЛГ в период стимуляции; требу­ется
меньшее количество препаратов ЧМГ, ФСГ и их комбинаций; реже возникает СГЯ; почти вдвое сокращается
продолжительность лечения.

Антагонисты назначают по 0,25 мг или по 3,0 мг подкожно на 6—7-й день стимуляции
суперовуля­ции или при диаметре лидирующего фолликула 14 мм в течение 4—5 дней.

Назначение овуляторной дозы ХГ осуществляет­ся по описанным выше критериям, доза
подбирает­ся индивидуально. Через 35—36 часов производится трансвагинальная пункция фолликулов в
целях аспирации фолликулярной жидкости и получения преовуляторных ооцитов.

Метод культивирования преовуляторных ооци­тов состоит из нескольких этапов.

1. Забор ооцитов. Полученную фолликулярную жидкость эмбриолог анализирует на
   предмет поиска ооцитов на стереомикроскопе. Найденные ооциты последовательно промывают в среде для
   промывки ооцитов и помещают в С0 2 -инкубатор в среде для культивирования.
2. Подготовка сперматозоидов. Из полученной спермы выделяют фракцию наиболее
   подвиж­ных сперматозоидов путем центрифугирования в градиенте плотности либо методом свободного
   всплытия.

Оплодотворение. В случае ЭКО: ооциты пере­носят в среду
оплодотворения, содержащую пред­варительно выделенные наиболее подвижные спер­матозоиды, и
помещают в С0 2 -инкубатор. В случае ИКСИ: ооциты очищаются от кумулисных клеток и инъектируются
сперматозоидами.

1. Оценка оплодотворения. Культивирование. Че­рез 16—18 часов с момента
   оплодотворения ооциты оценивают на предмет выявления признаков нор­мального оплодотворения. Аномально
   оплодотво­ренные ооциты уничтожают, нормально оплодо­творенные — переносят в среду
   культивирования и помещают в С0 2 -инкубатор, где инкубируют до переноса в полость матки. Среды
   культивирования меняют согласно протоколу культивирования, при­нятому лабораторией.
2. Перенос эмбрионов. Перенос эмбрионов осу­ществляется на третьи либо пятые
   сутки культиви­рования (считая оценку оплодотворения — первыми сутками культивирования). Для
   переноса эмбрионы в среде для переноса помещают в катетер, который передают гинекологу.

Эмбрионы, полученные после оплодотворения ооцитов одной и той же пациентки, как правило,
отличаются по скорости дробления и морфологиче­ским параметрам. Качество дробления эмбрионов
оценивается по количеству и размеру бластомеров, по наличию и количеству фрагментации.

Качество эмбрионов, достигших стадии развития бластоцисты, оценивается по количеству и
размеру клеток трофектодермы, по наличию и качеству вну­триклеточной массы, по объему полости и толщине
зоны пелюцида.

Количество переносимых эмбрионов, как прави­ло, составляет не более двух, поскольку при
увеличении числа эмбрионов увеличивается риск моногоплодной беременности, что влечет за собой серьезные
проблемы акушерского и социального характера.

Возможные осложнения после ЭКО те же, что и после ВМИ, плюс возможность наружного и
внут­реннего кровотечения.

Программа ЭКО — эффективный метод восста­новления фертильности у пар с
мужским фактором бесплодия при получении от 500 тыс. до 1 млн быстроподвижных сперматозоидов и более 5% их
мор­фологически нормальных форм после обработки спермы в градиенте плотности. При этом показатель
оплодотворения ооцитов — в среднем 70—80%, бе­ременностей на стимулированный цикл — около 30%,
родов — около 20% (табл. 26).

Доказаны следующие противопоказания к ис­пользованию метода ЭКО и ПЭ:

Абсолютные:

• - злокачественные новообразования любой ло­кализации, в том числе в анамнезе.

Относительные:

• - соматические и психические заболевания, яв­ляющиеся противопоказаниями для вынаши­вания
  беременности и родов; опухоли яич­ников;
• - доброкачественные опухоли матки, требую­щие оперативного лечения;
• - острые воспалительные заболевания любой локализации.